NY∕T 2729-2015 李属坏死环斑病毒检测规程(农业)
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.14 |
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页数： |
6 |
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日期： |
2021-12-24 |
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ICS 65.020,B 16 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2729一2015,李属坏死环斑病毒检测规程,Criterion for prunus necrotic ringspot virus detection,2015-05-21 发布2015-08-01 实施,中华人民共和国农业部发布,削昌,本标准按照GBjT 1. 1-2009 给出的规则起草,本标准由农业部种植业管理司提出并归口,NY/T 2729-2015,本标准起草单位:农业部花卉产品质量监督检验测试中心(昆明人云南省农业科学院花卉研究所、,国家观赏园艺工程技术研究中心、云南省花卉育种重点实验室、云南省花卉工程技术研究中心,本标准起草人:王丽花、瞿素萍、王继华、杨秀梅、吴学尉、王其刚、张艺萍、张丽芳、苏艳、彭绿春,I,NY/T 2729-2015,李属坏死环斑病毒检测规程,1 范围,本标准规定了李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus ?PNRSV) 的双抗体夹心酶联免疫,吸附检测法(DAS-ELISA) 和指示植物检测法,本标准适用于植物组织中李属坏死环斑病毒的检测,2 取样,根据样品属性，取发芽幼苗、腋芽、枝条韧皮部、果实表皮、叶片、鳞片外表皮等器官或组织，洁净水,洗净后备用,3 检测方法,3. 1 双抗体夹心酶联免瘦吸附测定法(DAS-ELISA),3. 1. 1 原理,利用抗原(病毒)与其特异性抗体在离体条件下产生专→性反应的原理。即存在于样品中的病毒颗,粒首先被吸附在酶联板孔中的单克隆抗体捕捉后，再与碱性磷酸醋酶标二抗结合反应，后加入碱性磷酸,酶底物，酶将底物水解并产生有色产物。颜色的深浅与样品中病毒的含量成正比，若样品不携带病毒则,无颜色反应,3. 1. 2 仪器、用具及耗材,酶标仪(配405 nm 滤光片) .恒温培养箱(温度可调范围O.C ~40.C). 生物培养箱(具光照、温度可,调范围OOC~500C) ， 电子天平(感量为0.01 g 、0.000 1 g) ，酸度计。微量移液器(200μL~l 000μL.,10μL~100μL， 0.5μL~10μL)，酶联板，研钵或自封袋，微量移液器吸头，离心管等,3. 1.3 试剂,3.1.3. 1 所用试剂均为分析纯，水为蒸馆水,3. 1.3.2 抗体和对照,PNRSV 抗体、阳性对照、阴性对照或DAS- ELISA 检测试剂盒均未自市售,3.1.3. 3 包被缓冲液(pH 9. 6 ，贮藏于4 0C),碳酸纳(Na2C03 ) 1. 59 g,碳酸氢铀(NaHC03 ) 2. 93 g,叠氮化纳(NaN3 ) 0.2 g,加蒸馆水溶解定容至1000 mL.,3.1.3. 4 洗涤缓冲液(PBST ， pH 7. 4),氯化纳(NaCl) 8.0 g,无水磷酸二氢悍(KH2 P04 ) 0.2g,无水磷酸氢二铀(Na2 HP04 ) 1. 15 g,氧化伺(KCl) 0.2 g,吐温20 (Tween-20) 0.5 g,加蒸馆水洛解定容至1000 mL ,3. 1. 3. 5 样晶提取缓冲液(GEB ， pH 7.4 ，贮藏于40C),1,NY/T 2729-2015,脱脂奶粉2.0 g,聚乙烯口比咯皖酣(PVP ,MW 24 ∞川0000) 20.0 g,元水亚硫酸铀(Na2S03) 1. 3 g,叠氮化铀(NaN3 ) 0.2 g,吐温一20(Tween-20) 20.0 g,溶于PBST 中，定容至1000 mLo,3. 1.3.6 酶标抗体稀释缓冲液{ECl ,pH 7. 4 ，贮藏于40C},牛血清白蛋白(BSA) 2.0 g,聚乙烯口比咯皖酣(PVP ,MW 24ω川0000 ),叠氮化铀(NaN3 ),溶于PBST 中，定容至1000 mL ,3. 1. 3. 7 底物缓冲液{PNP ， pH 9. 8 ，贮藏于4 0C},二乙醇胶,六水氯化模(MgC12 ?6H20),20.0 g,0.2 g,97.0 mL,0.1 g,NaN3 0.2 g,溶于800 mL 蒸馆水中，用2 mol/ L 盐酸调pH 至9.8 ，定容至1000 mL ,3. 1.3.8 底物溶液(现用现配),根据需要称取对硝基苯磷酸二铀(PNPP) 溶于底物缓冲液中配制成1 mg/mL 的底物溶液,3. 1.3.9 终止液{3 mo i/ L 氢氧化饷溶液),称取120 gNaOH ，溶于1000 mL 蒸馆水中o,3. 1.4 操作步骤,3. 1.4. 1 包被抗体,在酶标板孔中加人100μL 用包被缓冲液按工作浓度稀释好的抗体，将酶标板用保鲜膜包好放入湿,盒中，置于4 0C 冰箱内孵育过夜或室温(20 0C ~250C) 下孵育4 ho,3. 1.4.2 试样制备,将待测试样和GEB 按1 : 10(g/mL)的比例放入研钵或二三0.2mm 的加厚自封小塑料袋中磨碎至,匀浆，后转入离心管800 r/ min~ 1 OOOr/ min 离心2 min ，获得上清液。阳性对照、阴性对照的上清液制,备同上，阳性样品为己知的携带PNRSV 的材料或试剂盒提供的阳性对照;阴性样品为己知的不携带,PNRSV 的材料或试剂盒提供的阴性对照,3. 1.4.3 洗板,孵育结束后，将孔内液快速倒出，每孔加满PBST 清洗酶标板，清洗4 次~6 次，每次停留1 min~,2min。清洗完成后在洁净吸水纸上拍出孔内残液,3. 1. 4. 4 包被试样,吸取3. 1. 4.2 的上清液加入清洗完成后的酶标板，每孔加100μL……
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